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    技術知識

    做開發如何選擇色譜柱?

    發布時間: 2019-01-17 10:17   6080 次瀏覽

    做方法開發的小伙伴們經常會遇到這樣的情況,我們拿到一個樣品后,得知了樣品的部分屬性,但是在選擇色譜柱上面卻無從下手。因為譜柱的種類千差萬別,在USP(美國藥典)中色譜柱分類從L1-L46,竟然有這么多,我究竟該選擇哪一種色譜柱才更適合我呢?






    色譜柱種類很多,而且每個廠家的色譜柱也不一樣,有時候同樣是C18的色譜柱,不同廠家的色譜柱之間也會有差別,我們要想選擇合適的色譜柱,***需要對色譜柱的分類和內在性質有所了解,跟著麥哥(Max)一起梳理梳理吧。


    液相色譜柱***常用的分類方法為按照用途劃分,可以分為以下幾類:


    1.  反相柱RP(C18、C8、C4/C3)


    2.  正相柱NP


    3.  尺寸排阻柱(SEC)


    4.  離子交換柱(IEX)


    5.  親水相互作用柱(HILIC)


    我們下面針對這幾種色譜柱逐一進行講解:


    一、反相柱(RP,Reversed Phase)


    反相柱是實驗室使用***廣泛的色譜柱,它是以硅膠填料為基礎,中間鍵合了極性相對較弱的官能團鍵合相,流動相一般為極性較強的有機相(甲醇、乙腈)。溶質按其疏水性大小進行分離,極性越大疏水性越小的溶質,越不易與非極性的固定相結合,所以先被洗脫下來。而極性較小疏水性較大的物質,***被保留下來,隨著有機相比例增大,被依次洗脫下來。


    反相柱也有很多亞類,按照碳鏈的長短可以分為C18、C8、C4/C3。我們常說的ODS***是C18色譜柱(Octadecylsilyl,十八烷基硅烷鍵合硅膠填料),這種色譜柱常用來分析化學小分子物質,在生物制藥領域多用來進行氨基酸分析、多肽分析(<10KD),肽圖分析等。


    使用C18色譜柱需要注意的是,C18色譜柱能夠耐受的pH值一般在3-8之間, 過低或者過高的pH值都會損壞色譜柱,造成硅膠溶解。有些C18色譜柱能夠耐受的pH低至1,這些色譜柱往往是在C18硅膠填料的基礎上進行了化學修飾形成的,值得一提的是Waters的BEH(亞乙級橋雜化技術),高pH條件下柱穩定性的強化測試結果表明柱壽命比超純硅膠柱提高十倍以上,能夠顯著提高色譜柱的酸堿耐受性。此外,高鹽溶液(>0.5M)也容易造成一定的硅膠填料溶解,所以鹽溶液在分析過程中盡量要控制濃度,而且在與有機相進行混合的時候,比例要緩慢改變,否則容易造成鹽的沉淀堵塞色譜柱。


    上述pH與高鹽溶液都是對色譜柱具有不可逆破壞的物質,此外還有一些物質也會對色譜柱造成影響,但是可以經過一定的方法進行清洗再生。一些添加劑會造成峰型改變,例如SDS、吐溫、Triton等,可能造成柱壓升高,需要多沖沖柱子才能解決。


    此外,C18的色譜柱也盡量不要使用純水相,否則可能造成疏水塌陷,影響色譜柱的保留特性。如果出現疏水塌陷,需要使用高比例有機相過夜沖洗,可以進行恢復。


    C8和C4(有的廠家會出C3)色譜柱一般是針對大蛋白或者單抗的,碳鏈越短,對分子量較大的蛋白分析越有利。單抗一般選擇C4色譜柱,抗原或者單抗亞基(LC&HC)可以選擇C8色譜柱進行分析。值得一提的是分子量較大的蛋白在反相柱上都會有一定的殘留,這時候我們需要采取一定的措施較少殘留,不讓殘留在下一樣品上形成鬼峰。一般采取的措施是每個樣品之間走一個空白,并且提高色譜柱的柱溫至70-80℃。流動相的pH對樣品溶質的電離狀態影響也很大,進而影響其疏水性,所以在分離肽類和蛋白質等生物大分子的過程中,經常要加入修飾性的離子對物質,***常用的離子對試劑是三氟乙酸(TFA),使用濃度為0.1%,使流動相的pH值為2~3,這樣可以有效地抑制氨基酸上α羧基的離解,使其疏水性增加,延長洗脫時間,提高分辨率和分離效果。除此之外,還可以嘗試磷酸、醋酸、甲酸。


    二、正相柱(NP,Normal Phase)


    正相柱與反相柱相似,也是以硅膠填料為基礎,但是正相柱上鍵合的是極性相對較強的官能團鍵合相(如帶有二醇基、氨基、和氰基的固定相及硅膠、三氧化二鋁等),流動相一般為極性較弱的正己烷等物質。簡單來說,如果采用固定相的極性大于流動相的極性,***稱為正相色譜;如果固定相的極性小于流動相的極性,則稱為反相色譜。


    正相色譜一般用來分離中性化合物和離子化合物,主要以中性樣品為主。正相色譜分析的樣品有以下幾種:異構體、族類分離、易水解樣品、高脂溶性樣品。我們所知的氨基柱和氰基柱(官能團為-CN氰基、-NH2氨基)在正相色譜上使用都很多。由于正相柱在生物制藥領域使用不是很廣泛,我們在這里***不詳細說明了


    三、尺寸排阻柱(SEC,Size Exclusion Column)


    尺寸排阻色譜柱(SEC)是根據蛋白的分子量大小進行分離的一種色譜柱,采用的是多孔硅膠填料,分子量小的物質能夠進入到硅膠孔內,走的路程多,分子量大的物質被排阻在硅膠孔外,走的路程少。于是分子量大的物質***先流出,分子量小的物質后流出,通過這種方法***可以將蛋白分離開了。


    SEC色譜柱主要用于分析蛋白的聚集體狀態,在生物制藥領域蛋白質聚集體是需要嚴格控制的一個檢項,因為聚集體很可能會產生免疫原性,造成藥物的過敏反應。SEC可以很好的針對單抗,抗原等物質進行分析,分離出降解片段,單體,二聚體及多聚體。SEC色譜柱也有很多亞類,根據填料的孔徑大小分類,可以分為1000A,300A和150A等幾類。300A孔徑的色譜柱經常用來分析單抗以及雙特異性抗體,這類色譜柱的******分離范圍在30kd-200kd之間。1000A的色譜柱填料孔徑較大,適合分離大于200kd的大蛋白,以及一些ADC藥物。而150A的色譜柱填料孔徑較小,適合分離抗原或者多肽類藥物,它的******分離范圍在5kd-60kd之間。所以我們可以根據樣品的分子量大小選擇合適的色譜柱進行分離,值得一提的是SEC色譜柱基于它的特殊填料處理方式,似的硅膠顆?;静慌c蛋白發生相互作用,所以SEC色譜柱分離大蛋白不會產生蛋白殘留,是一種理想的單抗分離手段。


    SEC色譜柱一般使用緩沖鹽作為流動相,常用的是PBS(磷酸鹽緩沖液),相對于其他種類色譜柱,SEC色譜柱的壽命是比較短的。在SEC色譜柱使用久了以后會產生拖尾,或者峰展寬的情況,這時候我們可以對SEC色譜柱進行再生清洗。一般再生的方法有幾種,可以根據需要結合起來使用:


    1.    10%-20%甲醇低流速(正常流速的30%)沖洗15-20個CV(柱體積,column volume)


    2.    0.25M Na2SO4或者NaCl沖洗5CV,純水沖洗5CV,交替沖洗2次。


    3.    5%異丙醇(IPA)沖洗5CV,沖洗過程中可以滿環進樣6M鹽酸胍或者8M尿素,確保色譜柱上殘留蛋白的變性。


    以上方法沖洗可以對色譜柱進行再生,如果效果不是太好,可以嘗試進行反沖,但是對于亞2微米的色譜柱,不可以進行反沖,否則填料***會流失。如果進行了反沖,建議以后色譜柱反著使用,因為反沖后的色譜柱整體結構有一定損壞,雖然暫時性能提升了,但是柱效的下降要比新柱子快很多,所以反沖盡量要慎重選擇。


    有時候峰型變差可能是由于蛋白引起的,我們換一個樣品之后***好了,這是因為SEC色譜柱雖然是消除了蛋白與色譜柱的相互作用,但是現有技術無法做到****消除這種作用,對于某些蛋白仍然是會有一定相互作用的。這時候我們在分析過程中可以添加精氨酸或者2%的IPA,或者加入150mM NaCl去減弱這種相互作用,可以改善峰型。


    如果上述方法都沒有效果,那么我們可能需要更換一根新的色譜柱了。在以后的分析過程中,我們可以增加一根保護柱(guard column)或者加上在線濾器(online filter),都可以有效延長SEC色譜柱的壽命。


    四、離子交換柱(IEX,ion exchange)


    離子交換色譜柱在硅膠基質的固定相上鍵合SO3-、COO-、NH3+等離子官能團,使固定相帶上電荷。這種電荷與流動相中相反電荷的離子中和。當樣品帶有與固定相相反的電荷時,***被固定相抓取,隨著流動相中相反電荷增加,與樣品競爭性的和固定相結合,這樣***把樣品從固定相上取代下來,流出色譜柱。


    離子交換柱按固定相電荷種類不同可以分為陽離子交換柱(CEX),陰離子交換柱(AEX)。其中陽離子交換柱固定相上鍵合陰離子基團,又分為強陽離子交換柱(SCX)和弱陽離子交換柱(WCX);陰離子交換柱固定相上鍵合陽離子基團,又分為強陰離子交換柱(SAX)和弱陰離子交換柱(WAX)。生物制藥領域多使用弱陽離子交換柱(WCX),這是因為生物制藥針對大蛋白,且蛋白的等電點一般在中性左右,故使用比蛋白等電點低1個單位的WCX更加合適。


    WCX色譜柱主要用來進行電荷異構體的分析,根據不同的電荷異質性,我們可以得到相關的酸性峰,主峰和兩個堿性峰。再結合質譜技術,我們可以發現2個堿性峰是單抗的末端賴氨酸(Lys)引起的,主峰是缺失兩個Lys形成的,酸性峰是脫酰胺造成的。


    WCX方法的優化可以使用鹽梯度進行,也可以使用pH梯度進行,每家的儀器都有相關的離子交換方法開發軟件,方便我們對離子交換的溶液配制以及梯度調整,這里不再一一說明。


    五、親水相互作用柱(HILIC,Hydrophilic Interaction column)


    HILIC色譜柱是以硅膠基質,鍵合強親水性的極性官能團,利用水相和有機相作為流動相的一類色譜柱。HILIC色譜柱的使用方式和反相RP色譜柱正好相反,初始是較高的有機相,然后不斷的增加水相比例,將極性較強的物質依次洗脫下來。


    HILIC色譜柱在生物制藥領域主要用于糖基化(Glycosylation)的分析。糖基化是真核細胞(酵母、CHO)蛋白翻譯后修飾(PTM)的重要方式,糖基化的差異可能直接導致細胞的ADCC(抗體介導的細胞毒作用)、CDC(補體介導的細胞毒作用),以及一些免疫過敏反應(非人源化唾液酸NGNA),所以HILIC色譜柱進行糖基化檢測被廣泛應用在生物制藥領域。


    常見的色譜柱***是這些啦,在生物制藥領域主要使用RP、SEC、IEX、HILIC這幾種色譜柱,大家把這幾種色譜柱的主要使用環境牢記于心,在方法開發的時候***能夠游刃有余,選擇出適合自己分析的色譜柱了。

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